Leica TCS SP8 CARS 간섭성 안티-라만 산란 공초점현미경

❍ 세포의 분자이미징을 위한 가장 범용적인 장비로 CLSM이 있음. CLSM은 세포의 내 존재하는 세포내 소기관 및 각종 분자들의 분포를 3차원 영상으로 획득하는데 유리함. 그러나 관찰을 위해서는 세포에 형광물질을 투여해야만 하는데, 시간이 지나면 형광체의 발광이 사라져 지속적인 관찰이 힘들게 되는 광표백(photobleaching) 현상이 발생하고, 형광체의 독성으로 인하여 심지어 샘플이 죽게 되는 치명적인 단점을 가지고 있어 살아있는 세포를 연구하기엔 한계가 있음. 이러한 문제점을 극복하기 위해 개발되고 있는 방법이 바로 간섭성 반스톡스 라만 산란(Coherent anti-stokes Raman Scattering, CARS) 신호를 이용한 ‘CARS 분광 현미경’임. CARS 분광 현미경은 다양한 파장의 빛 가운데 특정한 빛을 선택하는 CLSM과 달리, 원하는 세포부위 분자의 진동을 강하게 유도하는 파장의 빛을 광원으로 이용함. 기본적으로 CARS는 최소 두 개의 서로 다른 파장을 가지는 펌프와 스톡스 광원이 필요함. 그리고 펌프와 스톡스 광원이 시간적․공간적으로 정확하게 일치하게 되면 새로운 파장의 anti-Stokes 신호가 발생하게 되는데, 이 신호를 이용하여 분광분석이나 이미징을 할 수 있음. 이 방식을 쓰면 방출되는 신호의 세기를 획기적으로 증대시킬 수 있기 때문에 세포에 형광물질을 투여하지 않고도 해상도가 높은 이미지를 얻을 수 있는 큰 장점을 가짐. 따라서 살아있는 세포의 실시간 이미징이 가능함. 1. CARS 파트 (1) 레이저 : picoEmerald (picosecond OPO + pump laser) - OPO : tunable from 780 nm to 940 nm pulsewidth at 1064 nm: typ. 7 ps pulsewidth OPO: typ. 5 - 6 ps spectral bandwidth: 0.3 # 0.4 nm repetition rate: 80 MHz avg. (Output power OPO: > 600 mW avg.) - Pump laser : fix at 1064 nm (Output power > 750 mW) (2) CARS Beam Routing to microscope : incl. EOM, interlock, Motorized filter wheel, etc.) (3) CARS Reflector Cube RSP850 for all 1 and 2 channel RLD detectors - For wavenumbers 2000-3500 cm-1 - Excitation wavelength > 760nm • CARS emission < 760nm (4) Blocking Filter CARS 2000 for HyD RLD (5) CARS Test sample - Polystyrene & PMMA beads Polybead PMMA microspheres 1-10 µm and Polystyrene (PS) microspheres 4.5 µm on microscope slides - Dodecane N-Dodecane microscope slides (6) Non-descanned Detectors - Two channel hybrid detector for non-descanned detection - Direct coupling to microscope in reflected light position. - Maximum quantum efficiency of ~ 45 % at 530 nm - NDD filter block : DAPI/FITC, FITC/TRITC, FITC/TXR, SHG440/CFP