RNA 유전자 치료제 개발 새 가능성 열었다

- IBS-서울대, 유전자 조절하는 마이크로RNA 생성의 비밀 잇따라 밝혀 네이처에 논문 2편 동시 발표 -

- 마이크로RNA 만드는 핵심 단백질 ‘다이서’ 작동 원리 알아내고 활성 상태의 다이서 구조 첫 규명...RNA 간섭 활용한 치료제 개발 기대 -

기초과학연구원(IBS, 원장 노도영) RNA 연구단 김빛내리 단장(서울대 생명과학부 석좌교수) 연구팀은 마이크로RNA(이하 miRNA) 생성과 RNA 치료제에 중요한 ‘다이서(DICER) 단백질’의 핵심 작동 원리를 밝혀냈다. 뿐만 아니라, 노성훈 서울대 교수 연구팀과 함께 지난 20여 년간 베일에 쌓여있던 다이서의 3차원 구조를 초저온전자현미경(cryo-EM) 기술을 활용해 세계 최초로 규명했다.

암을 비롯한 질병들의 원인을 밝히고 RNA 치료제 개발하는 데 크게 기여할 것으로 기대되는 두 연구결과는 세계 최고 권위지 네이처(Nature, IF 69.5)에 2월 23일(한국시간) 동시 게재됨으로써 그 학술적 가치를 인정받았다.

miRNA는 약 22개의 뉴클레오타이드(DNA나 RNA같은 핵산을 이루는 단위체)로 구성된 작은 RNA로, 단백질을 만들어내는 메신저RNA(mRNA)와 결합하여 특정 유전자의 발현을 선택적으로 억제한다. 즉, 유전자 발현과정을 조절함으로써 세포의 증식과 분화, 면역 반응, 노화와 질병 등 생명 현상의 모든 과정에 직간접적으로 영향을 미치는 유전자 발현 조절자다. 인간 몸에는 수백 종의 miRNA들이 존재하는데, miRNA는 그 재료물질인 기다란 miRNA 전구체가 드로셔(DROSHA) 단백질과 다이서 단백질에 의해 순차적으로 절단되는 독특한 과정을 거쳐 생성된다. 따라서, miRNA 전구체가 어떻게 절단되는지 규명하는 것은 생명현상과 질병에 대해 이해하는 데 매우 중요하다.

RNA 연구단은 이미 지난 연구에서 miRNA 생성 효소 중 하나인 드로셔의 기능과 구성을 규명하고, (Cell, 2015) 이어 드로셔의 3차원 구조를 세계 최초로 밝히는데 성공해 (Cell, 2016) 그 작동 원리를 이해할 수 있는 바탕을 마련한 바 있다. 이번에 연구한 다이서는, 드로셔에 의해 절단된 miRNA 전구체의 말단을 인지하고, 마치 재단사처럼 그 말단으로부터 특정 거리를 자로 재듯 잘라 miRNA를 만든다고 알려져 있었다. 그러나 miRNA 전구체의 말단은 세포 내 다른 단백질들에 의해 손상되기 쉬워, 이를 최적화하여 RNA 치료제에 응용하는 데 어려움이 있었다.

연구진은 다이서의 숨은 작동 원리를 확인하기 위해 RNA를 이루는 네 가지 염기인 구아닌(Guanine), 우라실(Uracil), 사이토신(Cytosine) 및 아데닌(Adenine)이 무작위로 구성된 miRNA 전구체를 백만 종 넘게 합성했다. 그 다음 이 전구체들을 다이서로 한꺼번에 자르고 정량적으로 조사할 수 있는 대규모 병렬 분석법을 적용해 다이서가 전구체를 절단하는데 필요한 서열을 발견했다. 이렇게 발견한 서열을 ‘GYM 서열’이라고 명명했다.

연구진은 다이서가 miRNA 전구체의 절단 위치를 결정하는데 GYM 서열이 중요하다는 것을 확인했다. 특히 기존에 알려진 것처럼 다이서가 드로셔에 의해 만들어진 말단만을 인지하여 절단하는 것이 아닌 miRNA 전구체의 내부 서열을 인지함으로써 스스로 절단 위치를 결정할 수 있다는 것을 밝혔다. 나아가 RNA 치료기술로 각광받고 있는 ‘RNA 간섭(RNA Interference, RNAi)’기술에 GYM 서열을 적용하여, GYM 서열이 RNA 간섭 효율을 크게 향상시킬 수 있다는 것을 확인했다. RNA 간섭은 인공적인 miRNA를 활용해 질병을 일으키는 유전자를 억제하는 기술이다. GYM 서열을 이용하면, 세포 내에서 정확한 miRNA를 다량 생산할 수 있어 유전자를 더욱 효과적으로 제어할 수 있게 된다.

나아가, 연구진은 세포 및 거대분자 이미징 핵심지원센터 노성훈 교수 연구팀과 공동으로 인간 다이서가 miRNA 전구체를 자르는 순간을 포착, 다이서-miRNA 전구체의 3차원 구조를 높은 해상도에서 관찰하는 데에도 성공했다. 인간 다이서 단백질의 3차원 구조는 지난 20여 년간 세계 여러 연구진의 노력에도 풀리지 않았으나, 공동 연구팀이 세계 최초로 활성화된 상태의 구조를 규명해낸 것이다. 이러한 성공에는 IBS와 서울대의 첨단 초저온전자현미경의 활용이 주요했다. 연구팀은 이 3차원 구조를 통해 다이서가 어떻게 miRNA 전구체를 인지하는지, 어떤 서열이 다이서와의 결합에 중요한지를 밝힐 수 있었다. 이러한 발견은 더욱 효과적인 RNA 치료제 개발을 가능하게 할 것이다.

또한, 공동 연구팀은 일부 암 환자들에게서 다이서의 특정 부분에 돌연변이가 발생한다는 것을 발견했는데, 이 돌연변이가 생기면 miRNA 전구체를 제대로 인지하지 못해 miRNA 생성에 심각한 문제가 생긴다는 것을 확인했다. 이 발견은 암 발병 기전에 대한 새로운 이해의 실마리를 제공할 것으로 기대된다.
김빛내리 단장은 “miRNA 생성과정을 이해하면 질병의 발병 원인을 파악하는 데 도움이 되고, RNA 간섭 효율을 높여 유전자 치료기술을 발전시킬 수 있다”고 전했다. 또한, “이번 결과는 장기간 연속성 있게 연구할 수 있는 환경이 주어진 덕분에 가능했던 것”이라며, “miRNA 생성과정에 대한 이해를 한층 확장하고 국제적인 경쟁력을 이어갈 수 있게 되었다”고 의의를 밝혔다.

[연구결과]

1. Sequence determinant of small RNA production by DICER (Nature, 2023)

이영윤*(IBS/서울대), 김해동*(IBS/서울대), 김빛내리#(IBS/서울대)

*공동 제1저자, #교신저자

2. Structure of the human DICER-pre-miRNA complex in a dicing state (Nature, 2023)

이영윤*(IBS/서울대), 이한솔*(서울대), 김해동*(IBS/서울대), 김빛내리#(IBS/서울대), 노성훈#(서울대)

*공동 제1저자, #공동 교신저자

마이크로RNA(miRNA)는 약 22 뉴클레오티드 길이의 짧은 RNA이다. 세포의 증식과 분화, 조직의 발달, 면역 반응, 노화와 질병 등 생명 현상의 모든 과정에 직간접적으로 중요한 영향을 미친다. miRNA는 전구체로부터 2단계에 걸친 정확한 절단 과정을 거쳐서 생성된다. 먼저 핵 내에서 RNA 중합효소에 의해 생성된 miRNA 1차 전구체가 드로셔에 의해 절단되고, 이로 인해 생성된 miRNA 2차 전구체가 핵 밖으로 나가 세포질에서 다이서에 의해 다시 한 번 절단되어 약 22 뉴클레오티드 길이를 가진 miRNA가 된다. 이후 miRNA는 아고넛(Argonaute) 단백질에 장착되어 다른 유전자의 발현을 특이적으로 조절하는 기능을 수행한다. 인간 몸에는 수백여 종의 miRNA가 있는 것으로 보고되었는데, 이들 대부분이 드로셔와 다이서에 의한 2단계 절단 과정을 통해 생성되는 것으로 알려져 있기에, 그동안 이러한 2단계 절단 과정의 정확한 기작에 대한 연구가 중요하게 이루어졌다.

RNA 연구단은 2015년 6월 드로셔와 드로셔의 파트너 단백질인 DGCR8의 기능과 구성을 규명하고, (Cell, 2015) 이어 드로셔의 3차원 구조를 세계 최초로 밝히는데 성공했다. (Cell, 2016) 이번 연구로 그 동안 베일에 쌓여있던 다이서의 작용 원리와 3차원 활성화 구조까지 밝혀 miRNA 생성 과정의 마지막 퍼즐을 맞췄다. 연구결과는 miRNA의 생성 과정에 대한 심도 깊은 이해를 가능하게 하고, miRNA를 이용한 신약 개발 등의 응용 연구에 대한 이론적 단초를 제공할 것으로 기대된다.

[연구 배경]

마이크로RNA(miRNA)는 모든 생명 현상의 중추인 유전자 발현에 핵심적으로 작용하는 물질이다. 세포 내에서 miRNA가 만들어지기 위해서는 miRNA 전구체가 잘려 miRNA가 생성되어야 하는데, 여기에는 다이서라고 하는 단백질의 역할이 필수적이다. 뿐만 아니라 이 생성 경로를 이용한 RNA 간섭 기술은 수많은 기초 연구에서 활용되고 있으며, 이를 바탕으로 한 RNA 치료제 또한 최근 각광받고 있다. 따라서 다이서의 작동 원리를 이해하면 생물학적 현상들을 이해하고 질병을 치료하는데 크게 도움이 될 수 있다.

다이서에 대한 연구는 2000년대 초부터 세계적으로 활발히 진행되어 왔는데, 그 결과 다이서가 miRNA를 생성하는 데에는 miRNA 전구체의 ‘구조’가 중요하다는 것을 알게 되었다. 하지만 이 원리만으로는 다이서가 세포 내에 존재하는 수많은 RNA들 중 miRNA 전구체를 어떻게 특이적으로 인지하는지, 그리고 miRNA 전구체의 절단 위치를 어떻게 결정하는지에 대해서는 여전히 이해가 부족했다. 특히, 수십 년간의 오랜 노력에도 불구하고 다이서가 어떻게 miRNA 전구체를 자르는지를 보여주는 3차원적 구조가 밝혀지지 않아 완전한 이해가 불가능했다.

[연구 과정]

대규모 병렬 분석법은 변인통제된 상황에서 엄청나게 다양한 수의 조작 변수들을 한 번의 실험으로 비교 분석할 수 있는 방법이다. 연구진은 이 장점을 활용하여 1,048,576개의 miRNA 전구체들을 한 번에 비교함으로써 miRNA의 생성에 RNA ‘서열’이 어떻게 관여하는지를 조사했다. 그 결과, 다이서의 절단 위치에서 특정 서열들이 큰 효과를 보인다는 것을 알게 되었는데, 그 서열들의 빈도를 반영하여 ‘GYM 서열'이라 명명했다 (‘G’는 염기쌍을 이루는 구아닌, ‘Y’는 염기쌍을 이루는 피리미딘 (pyrimidine, C/U), 그리고 ‘M’은 염기쌍을 형성하지 않는 사이토신과 아데닌).

이후 이 GYM 서열이 지니는 생물학적인 의의를 다각도로 규명했다. 먼저 다이서가 어떻게 GYM 서열을 인지하는지를 아미노산 수준에서 조사하였는데, 다이서의 이중나선 RNA 결합 도메인(double-stranded RNA-binding domain)의 특정 아미노산들이 GYM 서열을 인지하는데 중요하다는 것을 밝혔다. 또 GYM 서열이 실제로 miRNA 생성에 얼마나 중요한지를 살펴보고자 GYM 서열을 인지하는 아미노산들을 결함을 가진 것들로 바꿔 miRNA 생성에 어떠한 영향을 미치는지 조사했다. 그 결과, GYM 서열을 인지하는 것이 miRNA의 양과 서열을 결정짓는 데 매우 중요하다는 것을 밝혔다. 흥미롭게도 GYM 서열과 이를 인지하는 아미노산들이 동물계 전반에 걸쳐 매우 높은 수준으로 보존되어 있음을 확인하였는데, 이는 GYM 서열이 지니는 진화적 의의를 잘 보여준다.

연구진은 연구결과를 RNA 간섭 기술에 적용해 GYM 서열이 실용적인 측면에서의 가치도 높다는 것을 보여줬다. 두 가지 서로 다른 RNA 간섭 기술 플랫폼에 GYM 서열을 적용한 결과, GYM 서열 적용 시 두 경우 모두 더 빠르고 강한 효과를 얻을 수 있었다. 해당 연구 성과를 활용하면 더 효과적인 RNA 치료제 개발이 가능할 것으로 기대된다.

나아가 연구진은 서울대학교 분자 이미징 연구실 노성훈 교수, 이한솔 박사와 함께 수행한 다이서 구조 연구(두 번째 논문)에 GYM 서열을 적용하여 오랜 비밀로 남아 있던 활성화 상태의 다이서 구조를 밝혀냈다. 다이서는 GYM 서열을 지닌 miRNA 전구체를 효과적으로 자른다는 점에 착안하여, miRNA 전구체에 GYM 서열을 도입하고, 인간의 다이서 단백질과 함께 복합체를 구성했다. 그 후 초저온 전자현미경으로 그 구조를 관찰해 세계 최초로 활성화 상태의 3차원 구조를 포착했다.

이로써 다이서와 miRNA 전구체가 서로 어떻게 상호작용하는지 원자 수준으로 설명하는 것이 가능해졌다. 이 구조를 바탕으로 GYM 서열이 어떻게 인지되는지를 밝혔을 뿐만 아니라 전구체의 앞쪽 말단의 서열 또한 인지된다는 점을 새롭게 발견해 다이서가 어떻게 기질을 선택적으로 인지할 수 있는지 이해할 수 있게 되었다. 또한, 일부 암 환자에게서 발견되는 다이서의 돌연변이들이 어떻게 결함을 야기하는지를 구조적으로 설명할 수 있게 되었다.

[향후 연구계획]

다이서가 miRNA 전구체를 절단한 그 이후에 대한 분석을 실시하여, miRNA의 생성이 완료되는 과정을 밝혀 miRNA 생성 과정 전반에 대한 이해를 가능하게 할 계획이다. 다이서가 만든 miRNA가 기능하기 위해서는 아고넛(Argonaute) 단백질과 결합해야 한다. miRNA-아고넛의 결합 과정에서 다이서 등의 역할이 중요하다고 알려져 있지만, 이에 대한 분자생물학적 이해가 부족한 상황이다. 초저온 전자현미경과 생화학적 연구 기법을 이용하여 이들 단백질과 RNA가 서로 어떻게 상호작용하는지를 밝히고자 한다.

RNA 간섭에 활용되는 siRNA는 인공적으로 합성된 miRNA이기 때문에, siRNA를 만들어 RNA 간섭 효율을 높이기 위해서는 miRNA의 생성과정을 이해하는 것이 필요하다. 본 연구를 통해 밝혀낸 miRNA의 특징을 이용해서, RNA 간섭의 효율을 높이는 기술을 개발하고, 이를 유전자 기능 연구와 유전자치료 기술 개선에 활용할 계획이다.

[용어설명]

[그림설명]

[그림 1] 마이크로RNA의 생성 경로와 기능

① 마이크로RNA 최초전사체는 핵 내에서 드로셔-DGCR8 단백질 복합체에 의해서 1차적으로 절단된다.

② 이렇게 생성된 ‘머리핀’ 모양의 마이크로RNA 전구체는 세포질로 방출된 후 다이서에 의해 2차적으로 절단된다.

③ 그 결과 생성된 마이크로RNA 이중나선은 아고넛에 결합해서 그 중 한 가닥이 남아 복합체를 완성한다.

④ 아고넛에 들어간 마이크로RNA는 mRNA에 결합해 mRNA를 분해함으로써, mRNA로부터 단백질이 만들어지는 것을 막는다. 이러한 현상을 RNA간섭(RNA interference, RNAi)이라고 한다.

[그림 2] 다이서의 활성화 상태 구조와 마이크로RNA 전구체 서열의 중요성

(위) 비활성화 상태의 다이서(왼쪽 그림의 옅은 회색)가 마이크로RNA 전구체와 결합하기 위해서는 큰 구조적인 변화가 필요하다. 여러 세부 구조물들이 크게 움직여야 마이크로RNA 전구체와 밀착할 수 있다. 이때 다이서는 이중나선 RNA 결합 도메인을 통해 GYM 서열을, 플랫폼 도메인을 통해 5′말단을, PAZ 도메인을 통해 3′말단을 인지함으로써 마이크로RNA 전구체를 특이적으로 인식할 수 있다. 이렇게 결합한 마이크로RNA 전구체는 다이서에 의해 절단된다 (파란색, 녹색 화살표).

(아래) 마이크로RNA 전구체가 GYM 서열을 가지고 있지 않거나 5′말단 서열이 구아닌이면 다이서는 마이크로RNA 전구체를 효과적으로 자를 수 없다. 절단 효율과 정확도가 떨어지기 때문이 기능이 서로 다른 마이크로RNA들이 소량 만들어지게 된다. 일부 암 환자의 경우 다이서에 돌연변이가 생겨 동일한 문제를 겪게 된다. 반대로, 마이크로RNA 전구체가 GYM 서열 등 최적의 서열을 가진다면, 다이서는 정확하고 효율적으로 자를 수 있다. 그 결과 균질한 마이크로RNA가 대량 만들어질 수 있어 효과적으로 특정 유전자를 억제할 수 있다. 이 원리를 이용하면 RNA 치료제의 효과도 증폭시킬 수 있다.